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摘要：目的利用白及多糖（BSP）的生物黏附性，与海藻酸钠（SA）混合作为复合载体，以具有缓释特性的三七总皂苷（PNS）分散体作为包封药物，制备具有生物黏附性的PNS-BSP-SA复合微球。方法采用离子交联法制备微球，通过单因素试验和正交设计考察并优化处方工艺。通过扫描电镜（SEM）、粒径分布、差示扫描量热法（DSC）分析、溶胀性能测定、体外黏附性能评价、体外释放研究对微球进行表征。结果PNS-BSP-SA复合微球圆整度较好，表面粗糙不平有褶皱，粒径分布较窄，PNS原料药以无定形状态均匀分散于微球中。最佳处方工艺制备的微球工艺稳定，重现性较好，与直接加入PNS原料药制备的微球相比，PNS分散体微球的载药量、包封率和得率均明显增加，分别为10.34%、51.25%、82.21%，而PNS原料药微球的载药量、包封率、得率分别为4.04%、12.16%、61.35%。BSP的加入增加了SA微球的溶胀性能，明显增加了其在大鼠胃部的滞留率。PNS-BSP-SA复合微球中人参皂苷Rg1的释放较PNS原料药缓慢。结论BSP增加了微球的生物黏附性，将PNS制备为分散体，提高了微球的载药量、包封率和得率，并使微球具有一定的缓释性能。
白及多糖（Bletillastriatapolysaccharide，BSP）是白及中提取的一种黏性多糖，主要成分为葡甘聚糖，含有物质的量比约为3.0∶1或3.5∶1的甘露糖和葡萄糖[1-2]，具有止血凝血、抗炎、抗氧化、抗肿瘤等药理活性。BSP是一种天然高分子材料，具有良好的生物相容性、自身降解性、无毒副作用、黏膜黏附性等特点[3-4]，已成为缓控释系统、生物黏附靶向系统、基因转移和组织工程中的新型辅料[5-7]。本课题组前期研究中发现，BSP具有一定的生物黏附性，与生物黏附聚合物如海藻酸钠（sodiumalginate，SA）合用可增强其黏附性[8]。三七总皂苷（Panaxnotoginsengsaponins，PNS）是五加科人参属植物三七的主要活性部位，具有止血活血等药理活性[9-15]。利用BSP的生物黏附特性与常见生物黏附聚合物复合，构建具有胃黏膜保护作用的生物黏附给药系统，并以PNS作为包封药物，用于治疗消化性溃疡，可以发挥其在伤口愈合、止血、抗菌和抗炎中的治疗作用，以期达到药辅合一的效果，从而延长药物在胃部的滞留时间，增强局部治疗作用。本研究选择SA微球作为基础载体，将PNS制成疏水性高分子材料分散体混悬分散于SA与BSP的混合溶液中，经离子交联法制备PNS-BSP-SA复合微球，并进行处方工艺优化和表征。
1仪器与材料
1.1仪器
Waterse高效液相色谱仪，美国Waters公司；Milli-QSynthesis超纯水仪，美国密理博公司；BT25S电子分析天平，德国Satrorius公司；XP6百万分之一天平，瑞士Mettler-Toledo公司；MicroCL21R微量离心机，德国ThermoFisher公司；RE-A旋转蒸发器，巩义市予华仪器有限责任公司；DZF-真空干燥箱，上海申贤恒温设备厂；ZRS-8GD智能溶出试验仪，天津天大天发公司；F3差示扫描量热仪，德国Netzsch公司；S扫描电子显微镜（SEM），日本Hitachi公司；LS-激光粒度仪，美国BeckmanCoulter公司；85-2型恒温磁力搅拌器，上海司乐仪器有限公司；BT00-M蠕动泵，兰格恒流泵有限公司；KQ-DE数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；HY-45恒温气浴生物摇床，江苏省金坛市金城国盛实验仪器厂。
1.2药品与试剂
PNS，批号JZ，质量分数＞75%，南京景竹生物科技有限公司；对照品三七皂苷R1（R1）、人参皂苷Rg1（Rg1）、人参皂苷Re（Re）、人参皂苷Rb1（Rb1）、人参皂苷Rd（Rd）均购自上海源叶生物科技有限公司，HPLC测定各对照品质量分数均≥98%，批号分别为P02D7F、Z13O8L、B10M8S、Z16J9X、Z13N8X；BSP，多糖质量分数≥90%，批号SNT，西安斯诺特生物技术有限公司；SA，批号M20M8Y，上海源叶生物科技有限公司；聚丙烯酸树脂II，黏度≤50mPa·s，批号S04J6H1，上海源叶生物科技有限公司；无水氯化钙、磷酸二氢钾、氢氧化钠、氯化钠、盐酸均为分析纯，国药化学集团试剂有限公司；无水乙醇、甲醇均为分析纯；乙腈，色谱纯。
1.3动物
SD大鼠，雄性，体质量～g，南京中医药大学实验动物中心提供，许可证号SYXK（苏）-。
2方法与结果
2.1PNS分散体的制备
称取药物与载体比例为1∶1的PNS原料药和聚丙烯酸树脂II各1g，加入适量乙醇分别溶解，待充分溶解至澄清，将2种溶液混合均匀，45℃旋转蒸发除去有机溶剂，40℃真空干燥24h，粉碎过目筛备用。
2.2SA、SA-BSP、PNS-BSP-SA复合微球的制备
配制15mg/mL的SA溶液（0.3gSA溶于20mL水中），15mg/mLSA、30mg/mLBSP混合溶液（0.3gSA、0.6gBSP溶于20mL水中），15mg/mLSA、30mg/mLBSP、PNS分散体的混悬溶液（0.3gSA、0.6gBSP和适量PNS分散体溶于20mL水中），以及15mg/mLSA、30mg/mLBSP、PNS的混合溶液（0.3gSA、0.6gBSP和适量PNS原料药溶于20mL水中），采用离子交联法制备微球。使用注射器（13mm×0.45mm）将混合溶液逐滴滴入CaCl2溶液（称量一定量的CaCl2溶于水）中，室温持续搅拌交联一段时间，抽滤收集微球，纯水冲洗2次，40℃真空干燥24h，即得。
2.3PNS-BSP-SA复合微球中5种皂苷类成分含量测定方法的建立
2.3.1色谱条件色谱柱为WatersXBridgeC18柱（mm×4.6mm，5μm）；以乙腈-水为流动相，梯度洗脱：0～13min，20%乙腈；13～16min，20%～24%乙腈；16～20min，24%～26%乙腈；20～45min，26%～46%乙腈；45～50min，46%～75%乙腈；50～55min，75%～90%乙腈；55～60min，90%乙腈；60～65min，90%～20%乙腈；65～70min，20%乙腈；体积流量为1.3mL/min；柱温30℃；检测波长nm；进样量20μL。色谱图见图1。
2.3.2供试品溶液的制备精密称取微球样品适量，置于5mL量瓶中，加入70%甲醇定容至刻度，超声3h，补足减失的质量，摇匀，取续滤液，r/min离心10min，进样。
2.3.3线性关系考察精密称取R1对照品3.mg、Rg1对照品5.mg、Re对照品2.mg、Rb1对照品3.mg、Rd对照品3.mg，置于5mL量瓶中，加70%甲醇定容至刻度，配制成质量浓度分别为0.、1.、0.、0.、0.mg/mL的混合对照品储备液。精密吸取上述混合对照品储备液1mL，为各成分标准曲线最高质量浓度。另外精密吸取同一混合对照品溶液1mL，置于2mL量瓶中，加70%甲醇定容至刻度，混匀。按此法配制不同质量浓度的混合对照品溶液，按“2.3.1”项下色谱条件进样测定，分别获得各成分峰面积对质量浓度的回归方程为R1Y＝.3X－，r＝0.，线性范围5.14～.20μg/mL；Rg1Y＝.7X－，r＝0.，线性范围8.03～.00μg/mL；ReY＝.8X－.8，r＝0.，线性范围3.27～.20μg/mL；Rb1Y＝.03X－.36，r＝1.，线性范围5.97～.00μg/mL；RdY＝X－.24，r＝1.，线性范围4.69～.40μg/mL。5种成分的质量浓度在线性范围内与峰面积线性关系良好。
2.3.4精密度试验精密吸取同一份混合对照品溶液（R1、Rg1、Re、Rb1、Rd质量浓度分别为0.、0.、0.、0.、0.1mg/mL），连续进样6次，以各成分的峰面积值分别计算，结果R1、Rg1、Re、Rb1、Rd5种成分峰面积的RSD分别为0.87%、0.26%、0.39%、0.14%、0.16%，表明仪器精密度良好。
2.3.5重复性试验精密称取微球样品适量，平行6份，置于5mL量瓶中，加入70%甲醇定容至刻度，超声3h，补足减失的质量，摇匀，取续滤液，r/min离心10min，进样。计算R1、Rg1、Re、Rb1、Rd5种成分质量分数的RSD分别为0.76%、0.84%、0.76%、1.12%、1.18%，表明方法重复性良好。
2.3.6稳定性试验取同一份供试品溶液，分别于0、2、4、6、8、10、12、24h进样20μL，按“2.3.1”项下条件测定，计算R1、Rg1、Re、Rb1、Rd5种成分峰面积的RSD分别为0.43%、0.27%、0.31%、0.40%、0.39%，可见供试品溶液中各成分在24h内稳定。
2.3.7加样回收率试验称取已知含量的微球适量，平行6份，分别加入混合对照品溶液0.5mL（R1、Rg1、Re、Rb1、Rd质量浓度分别为0.、1.、0.、2.、0.mg/mL），按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，进样测定，计算各成分的回收率和RSD。结果R1、Rg1、Re、Rb1、Rd5种成分的回收率均在95%～%，分别为.59%、.49%、.39%、99.98%、.65%，RSD分别为1.94%、2.12%、2.24%、1.58%、1.59%，表明该方法准确可行。
2.4载药量和包封率的测定
供试品溶液的制备方法同“2.3.2”项下。供试品溶液中PNS的含量按“2.3.1”项下色谱条件进行测定，并按下述公式计算载药量、包封率和得率。
载药量＝微球中PNS原料药质量/微球总质量
包封率＝微球中PNS原料药质量/PNS投药量
得率＝微球总质量/总投料量
2.5PNS-BSP-SA复合微球的处方工艺考察
采用单因素试验考察SA与BSP质量比、SA与PNS分散体质量比、交联剂CaCl2质量浓度、交联时间、搅拌速度对复合微球形态、载药量和包封率的影响。
2.5.1SA与BSP质量比设定SA与PNS分散体质量比为1∶1，CaCl2质量浓度为50mg/mL，交联时间为10min，搅拌速度为r/min，考察SA与BSP质量比为1∶1、1∶2、1∶3时对复合微球性质的影响。结果表明，随着BSP比例的增加，复合微球的载药量下降，包封率提高，但变化不大。但是当SA与BSP质量比增加到1∶3时，由于混合溶液黏度变大，使得滴制困难且易拖尾，综合考虑下，最终选择SA与BSP质量比为1∶2。
2.5.2SA与PNS分散体质量比其余条件不变，考察SA与PNS分散体质量比为1∶0.5、1∶1.0、1∶1.5和1∶2.0时对复合微球性质的影响。结果表明，包封率呈现先增大后减小的趋势。两者比例从1∶1.0上升到1∶1.5，载药量有明显的增加，而从1∶1.5上升到1∶2.0时，载药量增加不明显。两者比例为1∶0.5时，载药量和包封率均较低。综合考虑下，选择SA与PNS分散体质量比为1∶1.0～1∶2.0，进行后续考察。
2.5.3交联剂CaCl2质量浓度其余条件不变，考察CaCl2质量浓度分别为30、40、50、70mg/mL时对复合微球性质的影响。结果显示，随着CaCl2质量浓度的增加，载药量逐渐减小，包封率呈现先增加后减小的趋势。这是由于交联剂质量浓度增加使复合微球交联更为致密，质量增加。综合考虑下，选择CaCl2质量浓度为30～50mg/mL，进行后续考察。
2.5.4交联时间考察交联时间分别为10、20、30、40min时对复合微球性质的影响。结果显示随着交联时间的增加，复合微球的包封率逐渐下降。而交联时间过短，会使交联不充分，复合微球成型性较差，综合考虑下选择交联时间为10～30min，进行后续考察。
2.5.5搅拌速度考察交联搅拌速度为、、、r/min时对复合微球性质的影响。结果表明搅拌速度的大小对复合微球载药量和包封率的影响同交联时间相似，随着搅拌速度的增加，PNS溶出增加，包封率逐渐下降。因此选择搅拌速度为～r/min，进行后续考察。
2.6正交试验优化处方工艺
根据单因素考察结果，选取4个因素SA与PNS分散体质量比（A）、交联时间（B）、CaCl2质量浓度（C）、搅拌速度（D），每个因素考察3个水平，进行L9(34)正交试验设计，其他条件为SA与BSP质量比为1∶2。以包封率和得率总和为指标进行综合评分，采用直观分析和方差分析法判断处方工艺优劣，结果分别见表1、2。由分析结果可知，各因素对包封率和得率总和影响的大小顺序为CaCl2质量浓度＞搅拌速度＞交联时间＞SA与PNS分散体质量比，并且由方差分析结果可知，CaCl2质量浓度对复合微球的包封率和得率总和有显著性影响。由此得出各因素的最佳组合为A1B2C3D1，即SA与PNS分散体质量比为1∶1，搅拌速度为r/min，交联时间为20min，CaCl2质量浓度为50mg/mL。
结合单因素试验中载药量测定结果，SA与PNS分散体质量比为1∶1时，复合微球载药量过低，比例为1∶3时，溶液黏度较大，复合微球粒径较大，部分微球呈不规则球状，由于此因素对复合微球指标无显著性影响，因此比例调整为1∶1.5。故最终处方和工艺因素确定为SA-BSP-PNS分散体1∶2∶1.5，CaCl2质量浓度50mg/mL，交联时间20min，搅拌速度r/min。
2.7验证试验
按最佳处方工艺制备3批PNS-BSP-SA复合微球，测定载药量、包封率和得率，进行工艺验证，结果见表3、4。结果表明，制备的3批复合微球工艺稳定，重现性较好。与直接加入PNS原料药制备的复合微球相比，PNS分散体复合微球的载药量、包封率和得率均明显增加。
2.8PNS-BSP-SA复合微球的表征
2.8.1外观形态采用SEM观察所制备的PNS-BSP-SA微球的整体形态以及表面结构。在检测前，样品先被分散黏附于导电胶带上并喷金，SEM的操作加速电压为3.0kV。由图2可见，复合微球整体呈球状，圆整度较好，且表面分布不均匀，较粗糙，有许多褶皱，可见大颗粒物质，推测为聚丙烯酸树脂II载体基质，可减缓药物的释放。载药后微球粒径变大，这与加入的疏水材料有关。
2.8.2粒径分布采用激光粒度仪对PNS-BSP-SA复合微球进行粒径测定，结果见图3。由图3可知，微球粒径分布较窄，平均粒径为（.9±.2）μm。
2.8.3差式扫描量热法（DSC）分析将PNS原料药、PNS分散体、SA-BSP复合微球（SA-BSP为1∶2）、PNS-BSP-SA复合微球进行DSC图谱分析。以空白坩埚为参比物，另一坩埚放入6～8mg的样品，温度范围20～℃，升温速率10℃/min，N2为保护气，保护气体积流量60mL/min；吹扫气体积流量40mL/min。由图4可知，PNS原料药在.4℃处有一明显吸热峰，判定为其熔融峰，PNS分散体仍然存在PNS原料药的熔融峰，但相对位置有所改变，为.8℃，并且其熔融峰吸收强度较PNS原料药减弱[16]。说明原料药被载体包覆，其结晶度进一步降低，导致熔融峰吸收强度降低。SA-BSP复合微球（SA-BSP为1∶2）在.8℃和.9℃存在吸热峰，载药后，PNS-BSP-SA复合微球在95.5℃和.3℃处存在吸热峰，PNS原料药的熔融峰消失，SA-BSP复合微球（SA-BSP为1∶2）的熔融峰依然存在。说明PNS的结晶度完全消失，以无定形状态均匀分散于微球中[17]，聚丙烯酸树脂II以及微球对PNS的包载可起到减缓药物释放的效果，并提高药物在胃肠道的稳定性。
2.8.4溶胀性能测定精密称取干燥复合微球mg置于pH1.2的盐酸溶液中，（37±1）℃恒温振荡。每隔一段时间取出擦净表面水分，迅速称质量（Wt），计算不同时间的溶胀率（SR）[18]，并绘制t-SR溶胀曲线。由图5可知，PNS-BSP-SA复合微球在5min时便达到最大溶胀率，为（63.71±2.64）%，随着时间的延长，其溶胀率缓慢减小。与SA微球和SA-BSP复合微球相比，PNS-BSP-SA复合微球的溶胀率明显大于SA微球，但稍小于SA-BSP复合微球。
SR＝(Wt－W0)/W0
W0为干燥微球质量，Wt为t时刻微球质量
2.8.5体外黏附性能评价雄性SD大鼠，禁食不禁水24h后ip10%水合氯醛，解剖取出胃，沿胃大弯剪开，使用生理盐水彻底冲洗干净，用胶水固定在玻璃片上。将50mg（～粒）微球均匀洒在胃黏膜上，置于相对湿度保持在92.5%（饱和硝酸钾溶液）的密封容器中，使复合微球充分水化溶胀，20min后取出。将玻璃片固定在45°支架上，调节蠕动泵转速，使0.1mol/LHCl（pH1.2）以6mL/min的速度冲洗胃组织5min，收集冲洗液中的微球并计数，计算复合微球在大鼠胃部的滞留率[19-20]。
滞留率＝N/N0
N为滞留的微球数目，N0为微球总数
由表5可知，加入了BSP的SA微球在胃部的滞留率明显增加，有显著性差异（P＜0.01）。载药后复合微球在大鼠胃部的滞留率几乎没有变化，载药复合微球有很强的黏附性，滞留率达98%。
2.8.6体外释药特性研究按《中国药典》年版四部规定的溶出度与释放度测定法中第三法（小杯法）进行释放度研究。以mL水作为溶出介质，温度（37.0±0.1）℃，转速r/min，分别于0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0h，取样1mL（同时补加同温度等量释放介质），以0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液20μL进行HPLC测定，计算PNS原料药、物理混合物、PNS分散体、PNS-BSP复合微球中Rg1的累积释放率，并绘制时间-累积释放率曲线。
由图6可知，与PNS原料药和原料药与载体的物理混合物相比，PNS分散体和PNS-BSP-SA复合微球中Rg1的释放明显减慢，其中，PNS分散体中Rg1在12h内的累积释放率达75%左右，PNS-BSP-SA复合微球中Rg1在12h累积释放率达90%以上，且两者均有一定的缓释效应。说明将PNS制备成PNS分散体可减慢药物释放，进一步制备成微球可以达到较好的缓释效果。这可能是因为PNS原料药的结晶度进一步降低，药物以无定形分散于微球中，从而使微球中药物的累积释放率进一步提高。
3讨论
由于BSP作为固体制剂的成型性较差，且前期研究发现BSP的生物黏附性相对较弱，因此从众多的生物黏附制剂类型中选择了制备过程温和、不涉及有机试剂且粒径小、比表面大、载药量高、本身具有黏附性的SA微球[21]，作为本课题制剂的基础载体。将SA与BSP复合后制备微球，不仅可以发挥BSP的生物黏附性，还可以弥补SA微球孔隙率大、机械强度较低的特点[22]。本实验采用离子交联法制备复合微球，该方法不涉及有机试剂，且可以避免油相对BSP黏度的影响，更好地发挥其生物黏附性。
PNS亲水性较强[23]，制备微球时易导致药物泄露，包封率降低。中药粉体改性技术可通过改变粉体的亲水性、疏水性、吸湿性、流动性、稳定性等性质，使原料药更好地符合制剂的要求[24]。因此，本研究考虑使用液相分散法与固体分散技术相结合，选择疏水性高分子材料作为PNS的载体，制备PNS分散体，以增强其疏水性并缓慢释药[25-26]。前期研究结果发现，聚丙烯酸树脂II可以起到包覆和粘合的作用，使药物粒子聚集，粒径变大，比表面积减小，导致药物在水中有阻碍的扩散，释放减慢。研究结果也显示，与PNS原料药微球相比，PNS分散体微球的载药量、包封率和得率均明显增加，且PNS分散体和PNS-BSP-SA复合微球中Rg1的释放明显减慢。
溶胀性能是评价生物黏附微球黏附性能的重要参数。溶胀发生在微球黏附的第一步，微球的溶胀能力就相当于微球从黏膜组织中吸收水分的能力，从而使微球和黏膜之间发生黏合作用[27-28]。因此，测定微球的溶胀能力在一定程度上反映了微球的黏附性能。BSP的加入可增加SA微球的溶胀性能，并增加其在大鼠胃部的微球滞留率，且载PNS后滞留率无明显变化。
本研究制备的PNS-BSP-SA复合微球圆整度较好，且载药量、包封率、得率均较PNS原料药微球提高。与SA微球相比，具有较强的黏膜黏附性能。微球具有一定的缓释性能，微球中Rg1在水中的释放相对于PNS原料药而言明显减慢。
参考文献（略）来源：吴雨佳，王令充，张雯，李俊松，狄留庆.生物黏附性三七总皂苷-白及多糖-海藻酸钠复合微球的制备及表征[J].中草药,,50(20):-.预览时标签不可点收录于话题#个上一篇下一篇