渔夫Talk
蚊子对伊迪杆菌感染的免疫应答因感染方式而异，aeedis在感染过程中始终保持增强的细胞表面修饰和信号能力。
库氏弧菌对宿主基本代谢物依赖较小，保留了剪接体成分的一部分，其转录组主要集中在生长和复制方面。
专性细胞内病原体要依赖与宿主的复杂相互作用，它们必须在宿主细胞内获取营养和其他代谢物，而微孢子虫的感染阶段在孢子中，包含一个很发达的注射装置，可以穿透宿主细胞。
蚊子幼虫吃了环境中的伊迪杆菌孢子后，会在胃盲肠（中肠的一个特殊部位）里水平传播，然后发育成第一个胞内孢子。
这些孢子穿透墙中肠并入侵宿主细胞，在那里发育成第二个胞内孢子，然后迁移到卵巢。
幼虫吃了环境中的孢子，孢子穿透中肠壁，然后在宿主从幼虫长到成虫的过程中，遍布全身，库氏弧菌又产生新的孢子，排到环境里。
微孢子虫基因组小，代谢能力弱，基因异常紧密，内含子少，基因间区小。但它们进化出了很多获取营养物质的机制，比如用ATP转运体从宿主细胞“偷”ATP。
参与宿主-病原体相互作用的微孢子虫基因还有逃避宿主免疫反应等方面，其分泌的蛋白质可能包含与宿主细胞蛋白相互作用以助病原体生长的效应物。
尽管基因大量缺失，但微孢子虫基因组仍编码了大量扩展的基因家族，尤其是具有分泌信号的物种特异性蛋白质，这些蛋白质据推测与这些宿主-病原体相互作用有关。
库氏弧菌基因组中每个碱基出现1个单核苷酸多态性（SNP），SNP频率为1/，平均等位基因平衡为58%。在伊蚊中发现的SNP数量和频率更高，每个碱基就出现1个SNP，SNP频率为1/，平均等位基因平衡为59%。
为了弄清这些物种的亲缘关系，我们找出了伊蚊、库氏弧菌和其他12种微孢子虫中的同源物种，结果发现，aeedis拥有的蛋白质编码基因在微孢子虫中最多，这反映出aeedis特有的基因。
以前的微孢子虫基因组分析，都有发现内含子和编码剪接体成分的基因会出现可变丢失的情况。
为了搞清楚这些微孢子虫生命周期的转录特征，我们从各个关键时间点对基因表达进行了量化，每个时间点都有两个独立样本。
样本间表达值的相关性表明，伊迪杆菌的转录可分为3个主要簇：环境孢子、水平传播的胞内阶段和垂直传播的胞内阶段。
culicis弧菌转录形成两个主要的集群：环境孢子和水平传播的细胞内阶段，没有明显的宿主生命阶段的额外集群。
经过对伊芽孢杆菌和库氏弧菌胞内阶段上调基因的评估，发现与孢子相比，这两个物种在发育阶段中对氧化石墨烯项的富集，重叠的部分很少。
库氏弧菌中上调的基因在与生长、碳水化合物代谢和DNA复制相关的氧化石墨烯项目上有富集。
aeedis中上调的基因主要涉及蛋白质修饰和运输途径，比如类异戊二烯合成、GPI锚定以及与高尔基-内质网运输相关的COPI（外壳蛋白）合成。
在aeedis的细胞内阶段，基因在生命周期水平或垂直部分特异性上调，这揭示了代谢潜力的变化和可能介导宿主相互作用的分泌蛋白的变化。
相比之下，生命周期水平部分未显示GO项富集。比较进食前后时间点，发现进食后分泌的己糖激酶和海藻化酶均显著上调。
由于aeedis具有明显的性周期，但在库氏弧菌中未发现减数分裂，所以我们在转录组的时程过程中，评估了真菌减数分裂基因的阶段特异性表达。
在一些微孢子虫物种中，发现HMG两侧的基因、RNA解旋酶和磷酸三糖转运蛋白（TPT）有部分同源性（但在人猿绦虫中没有明显的同源性）。
每个位点都有两个侧翼基因，一个是伊迪杆菌的RNA解旋酶，另一个是库利弧菌的TPT，这两个基因在每个组合中的不同支架上都有。
所鉴定的9个减数分裂基因，aeedis里至少有一个阶段表达，V.culicis里有SPO11和MSH4。
在感染样本中，碱性磷酸酶活性降低，蜜蜂肠道中部感染微虫后也出现了同样的情况，在中肠入侵过程中，感染样本中的铁稳态和运输增加了。
作为纤维蛋白原受体的α-整合素显著上调（qlt;0.），但不在ImmunoDB中。
其他类型的上调基因包括抗菌肽（防御素A和D）、clip结构域丝氨酸蛋白酶、c型凝集素、溶菌酶、丝氨酸蛋白酶抑制剂和含硫酯蛋白等，其中一些基因是通过GO项富集分析确定的。
孢子群包含在孢子囊内，并局限于受肌鞘限制的纤维上。
利用ImmunoDB对四斑蝽的基因进行了定位，发现在感染过程中任何时间点(负二项精确检验，qlt;0.05)唯一差异表达的免疫基因是抗菌防御素(SupplementaryData7)。
幼虫期时，防御素DEF1在感染过程中明显上升（qlt;0.05），成虫期时，DEF1在感染过程中也有所上升，但不明显（Plt;0.，qlt;0.2），库氏弧菌抑制了其蚊子宿主的大部分免疫反应。
我们对线虫的变异进行分析，用GATKunifiedgentyper做SNP鉴定，按最佳实践筛选（QD要小于2.0，MQ小于40.0，FS大于60.0，HaplotypeScore大于13.0，MQRankSum小于-12.5，ReadPosRankSum小于-8.0）。
对snp进行筛选，需要满足GATK基因型质量大于等于30、读取深度大于等于10的条件。然后，用UnifiedGenotyper发布了这两个程序集所有位点的比对统计信息，以便计算每kb可调用位置（读取深度至少为10，质量至少为30）的snp估计。
以每毫升1×和1×10?孢子的剂量，各取只埃及伊蚊幼虫，接触匀浆后的伊蚊孢子24小时，随后将每组各0只幼虫转入含有3升去离子水的56厘米×45厘米×8厘米塑料培养皿中。
提取埃及伊蚊(1×10(8)和7×10(7)孢子的最终产率)的RNA。
纯化后的aeedis和V.culicis孢子被制成团块，悬浮在μl的RNA裂解缓冲液中，然后加入等体积的硅化玻璃微珠（-μm），接着在mini-beadbeat-1（BioSpec）中，以48（转/分）的速度将悬浮液机械破坏30秒。
细胞计数确认孢子已被破坏，用玻璃珠去除裂解物，再进行RNA提取处理。
为了证明微孢子虫RNA提取成功，我们对合成cDNA的总RNA进行了qPCR，这是按基因组DNA方法做的。另外，我们还构建了链特异性文库，选的是用dUTP做的第二链标记方法处理的poly(A)RNA样本。
在IlluminaHiSeq上测文库，每个样本平均出7万对末端reads（-nt）；所有样本测序质量分都很高，平均29.2到34.6之间。
预测了一组初始蛋白质编码基因，用Prodigal和Genewise，要求蛋白质小于个氨基酸，且有良好的支持证据，如包含PFAM结构域匹配、非通用基因产物名称分配或两种方法的预测，利用Uniref90和可用的微孢子菌蛋白集。
把基因集中与重复元件（在重复元件中发现的匹配蛋白或PFAM结构域或TPSI命中（期望lt;1e-10和gt;30%覆盖率）对应的基因）对应的基因去除，描述的人类分离物的基因组没有被使用，NCBI中没有可用的组装，而非基因集。
最小和最大内含子大小分别是10和，只有符合基序预测且有拼接读映射的culicis基因才被认为含有内含子；没有伊蚊基因与配对配偶或预测基序的拼接读映射。
Argonaute和Dicer的同源物的存在确定了RNAi机制的存在。
用Bowtie将RNA-Seq数据与微孢子虫转录本序列比对，再用RSEM计算转录本丰度，最后用tmm标准化FPKM。
病原体在寄生周期、宿主免疫应答和寄主适应性方面存在多样性和复杂性。该病原体的适应性和致病性与基因家族扩张、基因重组和功能基因的丧失等进化事件有关。
蚊子微孢子虫病原体与其他物种之间存在基因流动和水平转移，这会影响病原体的遗传多样性和适应性进化。
微孢子虫病原体的相互作用和基因组进化研究对制定疾病预防和控制策略有指导作用，也能为新药物和疫苗研发提供理论基础。
《肯尼亚狒狒肠道原虫系统进化分析及毕氏肠微孢子虫群体遗传学研究》
[2]黄少康.比较研究两种微孢子虫的蛋白及对家蚕的侵染性
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[4]杨琼：《微孢子虫生物防治研究进展》
张瑞琳的《微孢子虫及人芽囊原虫混合感染与病原体形态观察》