本文来源：盛合瑞类器官、类器官学社
文章介绍
年9月4日，法国波尔多大学心胸血管研究中心IsabelleDupin教授团队在EuropeanRespiratoryJournal（IF：16.6）杂志发表最新成果：Anovelinvitrotubularmodeltorecapitulatefeaturesofdistalairways:Thebronchioid，研究结果表明，采用临床样本衍生的支气管类器官模型能够有效模拟远端气道的特征，并为研究呼吸系统疾病提供了新的高通量实验平台。
#1
研究背景
Background
阻塞性肺疾病（如慢性阻塞性肺疾病COPD）是全球主要的健康问题，气流受限是其主要特征。然而现有的气道培养模型（如2D气体-液体界面模型和气道类器官）在模拟小气道的三维结构和生理特性方面存在局限性。由于动物模型与人类气道差异显著，难以准确预测药物效果，因此开发更接近人类生理的体外模型显得尤为重要。本研究旨在通过生物工程技术创建一种新的支气管体模型，以更好地理解阻塞性肺疾病的机制并为药物筛选提供有效平台。
#2
研究思路
Methods
话不多说，小学社这就跟大家伙一起唠唠这项研究是怎么开展的。
1、细胞哪来？模型咋建？
首先，研究者从临床样本中提取人类支气管成人干细胞，作为构建支气管类器官的基础细胞；接着，将人类支气管成人干细胞封装在由海藻酸盐凝胶制成的管状支架中，构建出一个能够自发组织成管状结构的模型。
2、功能验证
在适宜的培养条件下，观察细胞的生长和分化情况，利用3D成像技术监测支气管类器官的形态变化。通过基因表达分析、单细胞RNA测序等技术，评估支气管类器官的上皮细胞连接、分化为纤毛细胞和杯状细胞的能力。同时，研究者还观察了纤毛运动的频率及其在慢性阻塞性肺病（COPD）患者细胞中的变化。
3、引入气-液界面，进行病毒感染实验
在模型中引入气-液界面，以调节细胞的基因表达和功能，模拟气道的生理环境。对支气管类器官进行病毒感染实验，验证其在模拟呼吸道感染方面的有效性。
4、数据分析、前景展望
通过对实验数据的分析，研究者发现支气管类器官具备良好的粘液纤毛和收缩功能，在再现远端气道特征和功能方面的优势，能够作为预临床研究的强大工具，评估与呼吸系统疾病相关的临床终点。
通过以上四步，研究者成功构建了一个具有生理相关性的支气管类器官模型，为未来的呼吸系统疾病研究提供了新的实验平台。
#3
主要结果
Results
从患者来源的基底细胞形成管状支气管上皮模型
这项研究成功构建了一个管状支气管上皮模型，使用了来自29名患者（其中18名非COPD患者和11名COPD患者）的基底支气管上皮细胞。研究者采用细胞胶囊技术，将支气管上皮细胞与Matrigel共同封装在海藻酸盐制成的管状结构中。结果显示，只有1个样本（3%）因技术问题未能生成支气管类器官。在29个样本中，有9个在9天内被完全使用进行早期特征分析，而在至少培养11天的19个支气管类器官中，有6个（32%）来自COPD患者，显示出与患者群体组成相符的比例。
支气管生成和培养的样本处理流程图
在培养的前24小时内，上皮细胞形成了覆盖整个管内表面的单层细胞。然而，支气管类器官在封装后1-2天内发生了塌陷。通过使用ROCK抑制剂Y-，研究者成功防止了上皮细胞的脱落，并降低了双磷酸肌球蛋白轻链的水平，表明细胞收缩性是导致塌陷的主要原因。
研究者还通过去除钙和镁阳离子成功溶解了海藻酸盐凝胶，生成了细胞悬液。流式细胞术分析显示，管状结构在至少9天内保持稳定和活性。为避免支气管类器官的塌陷，后续实验中持续使用Y-进行处理。流式细胞术确认了细胞的上皮特性，结果显示在第1天几乎所有细胞均对EpCAM和细胞角蛋白呈阳性，类似于在气-液界面条件下分化的支气管上皮细胞。RT-qPCR测定的CDH1（编码E-cadherin）和EPCAM的mRNA水平在时间上保持稳定。共聚焦成像和3D重建显示，支气管细胞组织成具有典型上皮形态和可见腔道的管状结构，类似于远端支气管的结构，细胞间接触处的ZO-1和肌动蛋白纤维的存在进一步确认了紧密连接的存在。
图1.充满原发性基底上皮细胞的藻酸盐管形成后被称为“支气管”。
图2.支气管模型中细胞上皮性质的特征。
支气管模型中的细胞分化和组织
在支气管类器官模型中，细胞分化和组织的研究显示，气道基底细胞基因角蛋白5（KRT5）的表达保持稳定，而TP63的表达逐渐下降。与此同时，俱乐部细胞分泌标记物SCGB1A1的表达显著上调。随着培养时间的延长，纤毛细胞标记物FOXJ1和DNAH5、转录因子AGR2以及粘液细胞标记物MUC5AC的表达逐渐增加。在第9天，这些基因的表达与在气-液界面（ALI）条件下的支气管上皮细胞相当，但EPCAM、SCGB1A1和MUC5AC的表达更高，而AGR2的表达则降低。
通过共聚焦显微镜观察发现，在第11天，纤毛细胞位于支气管类器官腔道的内层，大多数粘液细胞面向腔道，部分MUC5AC阳性细胞则位于外部。MUC5AC的阳性染色也出现在腔道内，表明存在粘液分泌。流式细胞术确认了基底细胞的逐渐减少，同时俱乐部细胞、粘液细胞和纤毛细胞的比例在非COPD来源的支气管类器官中逐渐增加，直到第21天。
相比之下，COPD来源的支气管类器官表现出明显的粘液表型，在第9天时粘液细胞的比例已经很高，并且这种表型持续到第21天，纤毛细胞的比例则保持较低。这导致在第21天时，COPD支气管类器官中粘液细胞的比例增加了五倍，而纤毛细胞的比例减少了八倍。
图3.原代支气管上皮细胞向细支气管的分化诱导。
非COPD支气管的单细胞表征
在对非COPD患者的支气管类器官进行单细胞RNA测序后，研究人员分析了来自两名患者的5,个高质量单细胞，并将其分类为9个不同的细胞群体。这些细胞群体根据已知标记物进行了注释，包括基底细胞（KRT5,TP63）、分泌细胞（SCGB1A1,SCGB3A1,MUC5B）、粘液细胞（MUC5AC,CEACAM5）、纤毛细胞（FOXJ1,TPPP3）、离子细胞（FOXI1,CFTR）等。研究还识别了分化中的基底细胞和增殖细胞。
通过使用CellTypist和人类肺细胞图谱（HLCA）模型进行细胞类型预测，验证了手动注释的细胞类型，显示出高度一致性。所有细胞类型均在两名患者的支气管类器官中观察到，尽管比例不完全相同。尽管在单细胞RNA测序数据中发现了分化的分泌细胞和多纤毛细胞，但未能识别出特定的终末气道富集分泌细胞群体。
最后，通过与HLCA和共同坐标框架（CCF）中的数据进行比较，评估了支气管类器官模型在转录水平上是否准确再现小气道。结果表明，支气管类器官的细胞状态与气道的细胞状态更为相似，尤其是与远端气道的细胞状态高度一致。这些数据支持了支气管类器官诱导远端气道命运的观点，表明其在转录水平上能够高保真地再现远端气道上皮细胞的特征。
图4.支气管模型中的单细胞转录组分析。
非COPD和COPD源性细支气管纤毛摆动的功能分析
在对非COPD和COPD患者来源的支气管类器官进行功能分析时，研究人员使用高速视频显微镜观察了纤毛的运动。对来自四名不同患者的支气管类器官进行分析后，测定了不同采集区域的中位纤毛拍打频率（CBF），结果显示中位CBF值范围为6Hz至27Hz，这与体内参考值相符，并与支气管上皮条、ALI培养和气道类器官中的频率相似。
非COPD患者来源的支气管类器官表现出生理性的双相拍打频率谱，而COPD患者来源的支气管类器官则失去了这种双相谱，并向较低频率偏移。这表明COPD可能影响纤毛的运动功能。
图5.使用高速视频显微镜分析对纤毛运动进行快速傅里叶变换(FFT)分析。
支气管模型中的鼻病毒感染和上皮反应
在支气管类器官模型中，研究人员测试了人类鼻病毒（RV16）感染，这是一种主要诱发哮喘和COPD加重的病毒。通过将携带绿色荧光蛋白（GFP）表达的重组RV16注入支气管类器官的腔内，研究人员追踪了病毒感染。注射体积估计在1μL至3μL之间，感染倍数（MOI）约为0.5至1.5。
感染48小时后，来自患者7和8的支气管类器官中，分别有95%和81%的细胞呈现GFP阳性，表明大多数细胞感染并复制了病毒RNA。而来自患者9的支气管类器官中，GFP阳性细胞的比例较低，仅为45%。接下来，研究人员评估了RV16对细胞因子分泌的影响，包括I型干扰素（IFN-β）、III型干扰素（IFN-λ1/3）和趋化因子CXCL8。结果显示，RV16-GFP感染显著增加了患者7和8的IFN-β、IFN-λ1/3和CXCL8的分泌水平，而在患者9的支气管类器官中未观察到干扰素的产生或仅有轻微的CXCL8水平增加，这与其较低的感染效率相符。
图6.支气管模型中的鼻病毒感染。
气传导细支气管模型的构建
为了构建一个空气导向的支气管类器官模型，研究人员在第3天通过支气管类器官的腔内插入了一根30G针，并连接到专用的灌注系统。通过注入空气并调整流速（0.2mL/min），保持了4小时的灌注，流速与内径为μm的远端支气管的循环流量相匹配。使用Calcein染色表明，经过4小时的空气灌注后，细胞仍然保持活性。
空气暴露导致所有灌注4小时的支气管类器官中SCGB1A1的系统性上调。其他基因的表达（如TP63、KRT5、FOXJ1、AGR2）则显示出没有变化，或根据实验的不同而有所变化（如DNAH5、MUC5AC）。尽管可能需要更长时间的灌注以观察更显著的效果，这表明空气-液体界面（ALI）在支气管类器官模型中对细胞分化的影响潜力。
图7.在支气管模型中建立气液界面。
总结
该研究展示了成功开发一种模仿远端气道的人类支气管上皮细胞的支气管体模型。到第21天，流式细胞术显示基底细胞分化为俱乐部细胞、杯状细胞和纤毛细胞，表明支气管体具有粘液纤毛清除的潜力。其细胞组成与气道类器官相似，尽管大约55%的细胞仍未被识别，可能主要由中间分泌细胞组成。支气管体模型与第17代细支气管非常相似，但缺乏某些特定于远端气道的细胞，这可能是由于使用了近端基底细胞以及实验中缺乏空气暴露所致。此外，来自COPD患者的支气管体表现出粘液表型，杯状细胞增加而纤毛细胞减少，提示分化途径发生了改变。该模型还展示了纤毛功能的改变，与其他关于COPD的研究结果一致。支气管体模型通过腔内注射实现了高效的病毒感染研究，例如鼻病毒，避免了传统类器官感染方法中遇到的复杂问题。研究强调了支气管体模型在呼吸系统疾病建模中的实用性，突出了其适应性和在特定肺病研究中的潜力。未来的改进，包括纳入非上皮细胞和先进的分析技术（如单细胞转录组学），预计将加深对肺病机制和治疗筛选的理解。
参考文献：
MauratE,RaaschK,LeipoldAM,etal.Anovelinvitrotubularmodeltorecapitulatefeaturesofdistalairways:Thebronchioid.EurRespirJ.PublishedonlineSeptember4,.doi:10./.-
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本文来源：盛合瑞类器官、类器官学社