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研究背景
风味是决定食品可接受性的主要因素。而风味物质本身可以与食物成分（脂肪、碳水化合物和蛋白质）发生相互作用，导致消费者对整体风味的感知发生变化。含羰基的风味化合物（如醛和酮）常用于风味物质和蛋白质相互作用的研究，其中香兰素（含羰基化合物）作为许多高蛋白产品的调味剂被广泛应用。椰子蛋白（CP）由椰子脱脂奶制成，与其他食物蛋白一样，其风味物质的相互作用可能导致CP中的风味减弱。通过蛋白质-谷氨酰胺酶（PG）脱酰胺改变椰子蛋白的风味结合特性，可以延缓CP风味减弱过程。
脱酰胺是一种影响蛋白质二级结构并导致构象变化的蛋白质修饰方法，而酶法已成为一种对蛋白质进行物理、化学改性的替代方法。从土壤中分离得到的PG酶能对蛋白质和肽链中的谷氨酰胺残基进行特异性催化，而不会像其他脱酰胺酶一样引起副反应。
研究结果
1
椰子蛋白的制备
通过等电点沉淀法制备椰子蛋白。采用索氏抽提法除去多余的脂肪，椰子脱脂奶中的椰子蛋白含量为3g/mL，其中蛋白质含量93%，水分含量5.6%，脂肪含量0.2%。
采用PG酶对椰子蛋白进行脱酰胺，PG酶脱酰胺程度和椰子蛋白水解度分别为36.1%和3.18%。由图1可知，脱酰胺和未做处理的椰子蛋白中均出现了18、22、30和55kDa的蛋白质条带，但条带的强度略有不同。脱酰胺椰子蛋白（DCP）中22kDa以下的蛋白质含量要高于未处理的椰子蛋白，这可能是由于PG酶对蛋白质也具有一定的水解酶活性作用。
图1SDS-PAGE条带对比：（a）分子量标记；（b）椰子蛋白；（c）脱酰胺椰子蛋白
2
香兰素和椰子蛋白（CP）、脱酰胺椰子蛋白（DCP）的结合特性
在采用平衡透析法研究香兰素与椰子蛋白结合特性前，研究人员测定了每种条件的孵育时间，以确定合适的平衡时间。5℃、15℃和25℃下CP、DCP和香兰素之间的结合相互作用如图2所示。平衡时间是游离香兰素的浓度达到稳定时的最短时间。因此，香兰素和CP的结合平衡时间在5℃、15℃和25℃下分别为48h、24h和6h，而与DCP结合平衡时间分别为48h、24h和3h。
图2香兰素与椰子蛋白（CP，■）和脱酰胺椰子蛋白（DCP，◆）在5℃、15℃、25℃下的结合平衡曲线
在三种温度下做出的双倒数图（Klotz图像）可以更好地确定香兰素和椰子蛋白、脱酰胺椰子蛋白的结合亲和性。在图3中，所有图像呈线性变化，表明香兰素与CP和DCP的结合是独立的。在表1中，所有方程的决定系数（r2）均高于0.。
图3香兰素与椰子蛋白（CP）和脱酰胺椰子蛋白（DCP）在5℃（a）、15℃（b）、25℃（c）结合的Klotz图像（ν=每摩尔总蛋白结合香兰素的摩尔数）
表1香兰素与椰子蛋白（CP）和脱酰胺椰子蛋白（DCP）结合Klotz图像的线性方程
由Klotz方程得到n和K，其中n表示结合位点数，K表示结合常数，如表2所示。在5℃和15℃下，n值没有显著差异；当温度升高至25℃时，n值增大。K值随着温度升高而降低。对于香兰素和去乙酰蛋白的结合来说，PG酶的脱酰胺能引起蛋白质二级结构的变化（α-螺旋减少，β-折叠增加），导致了n和K值的差异。这可能是由于蛋白质亚基重排，特别是在低温下，蛋白质分子内疏水相互作用减弱所致。因此，n和K值都能因蛋白质外表面的结合位点的重排数量而发生改变或保持相同。
nK值可以用于更准确地描述整体亲和力。结果表明，香兰素与CP、DCP结合的nK值都随着温度升高而下降，这可能是由于低温下分子内疏水相互作用较弱，蛋白质重排暴露疏水结合位点，结合更多的香兰素。此外，香兰素与CP结合的nK值比与DCP结合的nK值更高，表明PG酶的脱酰胺导致香兰素与椰子蛋白总体亲和性降低。这可能是PG酶导致的蛋白质构象变化引起两者结合能力的下降。
当香兰素和椰子蛋白及脱酰胺椰子蛋白结合时，ΔG°均为负值，表明结合过程是自发进行的；ΔH°均为负值，表明结合过程为放热反应，对相互作用有利；此外，ΔS°也均为负值。由于ΔS°并不能改变ΔG°的性质，因此香兰素和椰子蛋白、脱酰胺椰子蛋白的相互作用是由焓驱动的。由于本实验中焓变和熵变均为负值，表明相互作用可能包含范德华力或氢键。
表2香兰素与CP和DCP结合的热力学参数
3
脱酰胺对模型系统中香兰素气味检测阈值的影响
仪器测试方法能解释相互作用的类型和蛋白质-风味物质的结合行为，但不能测定相互作用对消费者风味感知的影响，感官评定也很重要。作者采用气味检测阈值描述PG酶的脱酰胺对椰子蛋白和香兰素结合作用的影响。表3列出了CP和DCP混悬液中香兰素的最优估计阈值（BETs），其中CP组最优估计阈值几乎是DCP组的两倍，意味着在PG酶脱酰胺之后，专门小组成员能够感知的香兰素风味浓度降低。脱酰胺能导致共价键或疏水相互作用变成较弱的相互作用，如氢键或范德华力，与香兰素与椰子蛋白和脱酰胺椰子蛋白结合后的n、K值变化结果一致。
表3水模型中CP和DCP中香兰素最优估计阈值
结论与展望
PG酶能使椰子蛋白部分脱酰胺，降低椰子蛋白和香兰素的亲和性。香兰素和CP、DCP的结合都由焓驱动。该研究从热力学角度解释了香兰素和CP的结合作用强于和DCP的结合作用。感官评定结果表明DCP的BETs降低。对生产富含蛋白质食品（特别是椰子蛋白食品）的工厂来说，明确脱酰胺可降低风味物质（香兰素）与蛋白质相互作用的机制，能有效减少高蛋白食品中的风味减弱问题。要理解蛋白质与风味物质相互作用及对消费者感官的影响，还需要进一步的热力学、仪器方法及感官研究。
论文信息
原名：Flavorbindingpropertyofcoconutproteinaffectedbyprotein-glutaminase:Vanillin-coconutproteinmodel
译名：基于香兰素-椰子蛋白模型研究蛋白质-谷氨酰胺酶对椰子蛋白风味结合特性的影响
期刊：LWT-FoodScienceandTechnology
IF：4.
发表时间：.05
通讯作者：InthawootSuppavorasatit
通讯作者单位：朱拉隆功大学?
撰稿：杨梦蝶
排版：杨梦蝶
审核：王一凡方东路
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